Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) - сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных - от 2 до 8 нм. В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий - периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами - β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом - антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У присутствует дополнительная структура - внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов. Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют - предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий - с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму. Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Простые методы окраски

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Сложные методы окраски

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных - он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% - 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% - 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах, концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные - в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание - удаление комплекса генцианового фиолетового с

Йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным - гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена

1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1 -2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: раз-

ветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Окрашивание по Граму - это экспрессный метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий в образце и дифференцировать их как грамположительные либо грамотрицательные. Метод основан на химических и физических свойствах клеточной оболочки. Метод Грама почти всегда применяют в качестве первого шага при диагностике бактериальных инфекций .

Метод был предложен датским ученым Г.К.Грамом , который разработал его в 1882 и опубликовал в 1884 году, как способ, позволяющий дифференцировать сходные по симптомам бактериальные инфекции: Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae .

Шаги

Часть 1

Приготовьтесь к работе. Наденьте перчатки и подвяжите длинные волосы, чтобы не загрязнить исследуемый образец. Выберите рабочее место под вытяжкой или в другом хорошо проветриваемом месте и продезинфицируйте его. Прежде чем приступить к работе, проверьте, исправны ли горелка Бунзена и оптический микроскоп.

Продезинфицируйте предметное стекло. Если предметное стекло недостаточно чистое, вымойте его водой с мылом, чтобы удалить жир и грязь. После этого продезинфицируйте его этанолом, очистителем для стекол или другим способом, который принят в вашей лаборатории.

Поместите образец на предметное стекло. Окрашивание по Граму позволяет увидеть отдельные бактерии в медицинских образцах или культуры бактерий в чашке Петри. Для начала нанесите на предметное стекло тонкий слой исследуемой жидкости. Рекомендуется не выдерживать образец дольше 24 часов, так как со временем у бактерий повреждаются клеточные стенки, и их реакция на окрашивание по Граму становится менее предсказуемой.

Зафиксируйте образец. Под действием тепла бактерии пристанут к стеклу, и их не смоет при окрашивании. Быстро проведите 2-3 раза предметным стеклом над верхней частью пламени горелки или нагрейте его на электрическом нагревателе. Не перегрейте предметное стекло, чтобы не внести изменения в образец. Если вы используете горелку Бунзена, следите, чтобы пламя было небольшим и имело вид голубого конуса, а не высокого оранжевого столба.

• Можно зафиксировать препарат и метанолом. Нанесите на высушенный образец 1-2 капли метилового спирта, слейте излишки спирта и высушите предметное стекло на воздухе. Данный способ предпочтительнее в силу того, что он меньше повреждает исследуемые клетки и дает более чистый фон.

1. Поместите предметное стекло в лоток для окрашивания. Этот лоток представляет собой неглубокое металлическое, стеклянное или пластиковое блюдце с мелкой сеткой для поддержки образцов. Положите стекло с препаратом на сетку, так чтобы используемая при окраске жидкость стекала в лоток.

   Нанесите на образец йод, затем смойте его. С помощью пипетки покройте образец йодом. Оставьте йод хотя бы на 60 секунд, после чего аккуратно смойте его водой так же, как раньше смыли краситель. Йод в виде отрицательно заряженных ионов взаимодействует с ионами КФ+, в результате чего во внешних и внутренних слоях клеток формируются крупные комплексы кристаллвиолета и йода. Это фиксирует попавший в клетки кристаллвиолет.

   • Йод является едким веществом. Избегайте контакта йода с кожей, не глотайте его и не вдыхайте его пары.

2. Добавьте обесцвечивающее вещество и сразу же смойте его. Обычно используют смесь ацетона и этанола в пропорции 1:1, при этом следует аккуратно выдержать время. Расположите предметное стекло под углом и добавляйте на него обесцвечивающее средство до тех пор, пока стекающая жидкость не потеряет фиолетовый оттенок и станет прозрачной. Обычно это занимает не более 10 секунд, особенно если обесцвечивающий раствор содержит большое количество ацетона. Если вы вовремя не остановитесь, раствор может вымыть краситель как из грамположительных, так и грамотрицательных клеток, и вам придется повторить процедуру окрашивания. Немедленно смойте остатки обесцвечивающего раствора так же, как делали это ранее с красителем.

   Нанесите на образец контрастный краситель и смойте его водой. Контрастный краситель, в качестве которого используют обычно сафранин или фуксин, позволяет получить дополнительный контраст между грамположительными и грамотрицательными клетками за счет того, что окрашивает бесцветные (грамотрицательные) бактерии в розовый или красный цвет. Оставьте контрастный краситель на образце хотя бы на 45 секунд, после чего смойте его водой.

   Высушите предметное стекло. Можно просто оставить его на воздухе, либо промокнуть фильтровальной бумагой. После этого окрашивание по Граму завершено.

Часть 3

Подготовьте оптический микроскоп. Положите стекло с образцом на предметный столик. Бактерии значительно различаются по размерам, поэтому вам может понадобиться увеличение от 400x до 1000x. При тысячекратном увеличении для лучшего контраста рекомендуется использовать объектив с масляной иммерсией. Нанесите на предметное стекло каплю иммерсионного масла, и при этом старайтесь, чтобы стекло не двигалось, иначе в масле могут образоваться пузырьки. Затем с помощью турели микроскопа выставьте необходимый вам объектив так, чтобы он коснулся масла.

• Метод масляной иммерсии применим лишь для специальных, а не "сухих" объективов.

1. Определите грамположительные и грамотрицательные бактерии. Рассмотрите предметное стекло под оптическим микроскопом. Грамположительные бактерии будут окрашены в фиолетовый цвет, поскольку внутри их толстых клеточных стенок оказался кристаллвиолет. Грамотрицательные бактерии должны быть розовыми или красными, так как кристаллвиолет был вымыт через их тонкие клеточные стенки, после чего в них проник розовый контрастный краситель.

   • Если образец слишком толст, это может привести к ошибочным положительным результатам. Если бактерии всех типов выглядят как грамположительные, окрасьте еще один образец, чтобы удостовериться в правильности результатов.
   • Если образец слишком долго находился под воздействием обесцвечивающего раствора, это может привести к ошибочным отрицательным результатам. Окрасьте еще один образец, чтобы убедиться в том, что все бактерии действительно грамотрицательные.

2. Сравните свои результаты с эталонными изображениями. Если вы не уверены в том, какие бактерии видите, то просмотрите набор эталонных изображений, которые отсортированы по форме бактерий и результатам окрашивания по Граму. Подобный набор можно найти в Интернете на National Microbial Pathogen Database , Bacteria in Photos и многих других сайтах. Ниже приведены наиболее распространенные или важные для диагностики примеры, которые помогут вам идентифицировать бактерии.

   Распознайте грамположительные бактерии по форме. Вид бактерий можно определить по их форме в микроскопе: часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные). Вот несколько распространенных форм грамположительных (фиолетовых) бактерий:

   Распознайте грамотрицательные бактерии. Часто грамотрицательные (розовые) бактерии разделяют на три группы: кокки (округлые), палочковидные (длинные и тонкие) и кокковидные, которые имеют промежуточную форму.

   Оцените неоднозначные результаты. Некоторые бактерии не поддаются однозначному окрашиванию из-за того, что их клеточные стенки непрочны или покрыты жирами. Такие бактерии могут одновременно окрашиваться в фиолетовый и розовый цвет в пределах одной клетки, либо клетки одного и того же вида могут окрашиваться по-разному в одном мазке. Подобная проблема может наблюдаться на любом образце бактерий, который пролежал более 24 часов, однако некоторые виды бактерий подвержены этому независимо от свежести образца. В этом случае для точного определения бактерий могут понадобиться более специализированные методы, такие как окраска по Цилю-Нильсену, наблюдение за ростом культуры, тест TSI (тройной сахар железа), генетическое тестирование.

   Выбросьте использованные материалы. Процедура утилизации отходов зависит от конкретной лаборатории и того, какие материалы использовались. Как правило, жидкость из лотка для окрашивания считается опасным материалом и переливается в плотно закрывающиеся бутылки. Использованные предметные стекла вымачиваются в 10%-ном растворе отбеливателя, после чего помещаются в контейнеры для сбора и утилизации игл и медицинских отходов.

Что вам понадобится

• Образец ткани
• Стеклянные предметные стекла
• Пипетка
• Источник пламени, нагреватель предметных стекол или метанол
• Кристаллический фиолетовый
• Обесцвечивающая жидкость, например спирт или ацетон
• Сафранин

Дополнительные статьи

источников

1. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
2. Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.
3. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
4. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
5. http://www.austincc.edu/microbugz/gram_stain.php
6. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
7. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2

Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.
А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.

1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.
Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.
1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.
В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.
1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.
2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.
Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.
1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.
2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).
1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.
2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).
Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.
1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.
2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).
3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.